محصول زنوگرفت استخوانی Bone+B یک نوع ماتریکس استخوانی غیرآلی است که بواسطه حذف ترکیبات آلی از استخوان اسفنجی گاو تهیه شده است. برای تولید Bone+B، منطبق با روش های دقیق علمی و به منظور حذف ترکیبات آلی از قبیل پروتئین ها، DNA، سلول های خونی و چربی و البته حفظ ساختار متخلخل و کریستالی هیدروکسی آپاتیت، استخوان های گاوی تحت تیمارهای شیمیایی و حرارتی قرار می گیرند. آنالیز میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) پودر استخوانی Bone+B، تائید کننده ساختار متخلخل این محصول می‌باشد.

در بزرگنمایی 50x (تصویر اول سمت راست)، ساختمان چندوجهی و متخلخل گرانول های استخوان Bone+ B و شباهت آنها به استخوان اسفنجی انسان قابل مشاهده است.

در بزرگنمایی 500x (تصویر وسط)، میکروپورها و مجرای هاورس (Haversian) مشاهده می شود.

در بزرگنمایی 10000x (تصویر اول سمت چپ)، ساختمان کریستال کروی ناصاف (Rough Spheroid) مشابه با ساختار کریستالی استخوان اسفنجی انسان قابل مشاهده می باشد.

- باز جذب آهسته در طی چند ماه تا بیش از چند سال
- سطح ویژه و تخلخل بسیار بالا
- بستری مناسب برای رگزایی و تشکیل استخوان های جدید
- زیست سازگاری تائید شده
- دارای ساختار اسفنجی یکپارچه مشابه با استخوان اسفنجی انسان
- کاربرد آسان به دلیل اتصال گرانول ها به یکدیگر پس از هیدراتاسیون

زنوگرافت Bone+ B ماتریکس استخوانی غیرآلی است که برای مصارف Periodontal و جراحی های Maxillofacial و Oral تولید شده است. ساختار متخلخل این استخوان غیرآلی از رگزایی و تشکیل استخوان جدید حمایت می کند. این محصول به دو صورت قوطی (جار) و سرنگی عرضه می شود.

تست های زیست سازگاری انجام شده

- ارزیابی ژنوتوکسیسیتی

هدف: بررسی اثر ژنوتوکسیسیتی Bone +B

Bone+B به روش comet assay، ابتدا محلول نرمال سالین به پودر استخوانی اضافه شده و به مدت یک هفته در دمای 37 درجه سانتی گراد نگهداری شد. از محلول عصاره گیری و فیلتر شده به دست آمده برای تیمار سلول های L929 استفاده شد. برای این منظور، سلول های L929 در پلیت های 24 چاهکی کشت شده و با عصاره Bone+B تیمار شدند. از نرمال سالین و هیدروژن پراکساید به ترتیب به عنوان کنترل منفی و مثبت استفاده شد. پس از انکوباسیون پلیت ها به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد، 50 ماکرولیتر از هر نمونه با 50 ماکرولیتر از آگارز محلول، مخلوط شده و از سوسپانسیون به دست آمده برروی اسلاید مخصوص تست Comet assay، گستره تهیه شد. اسلایدها پس از دو نوبت شستشو توسط 1XTBE، به مدت 10 دقیقه الکتروفورز شده و در نهایت پس از فیکساسیون، خشک شدن و رنگ آمیزی اسلایدها با اتیدیوم بروماید، توسط میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شدند.

یافته ها: نتایج تست comet assay به صورت میانگین طول دم و سر DNA متعاقب تیمار سلول ها توسط عصاره Bone+B اندازه گیری شده و توسط تست های آماری one - way ANOVA، unpaired Student’s tو Dunnet’s post hoc مورد ارزیابی قرار گرفتند.

عصاره Bone+B تغییرات معناداری در مقایسه با گروه کنترل از خود نشان نداد و نتیجه تست Comet assay در مقایسه با گروه کنترل، منفی شد.

نتيجه: با توجه به بخش 3 از استاندارد 10993، ماده آزمون Bone+B فاقد اثر ژنوتوکسیسیتی می باشد.

- ارزیابی تب زایی

هدف: بررسی اثر تب زایی Bone+B

Bone+B ابتدا محلول نرمال سالین به پودر استخوانی اضافه شده و برای مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد.

سپس از محلول فیلتر شده به دست آمده برای تزریق به خرگوش استفاده شد. برای این منظور، یک خرگوش سالم و بالغ انتخاب شده و 30 دقیقه قبل از تزریق عصاره پودر استخوان، دمای بدن خرگوش توسط دماسنج دقیق که درون رکتوم خرگوش به عمق کمتر از 5/7 سانتی متر قرار گرفته بود، اندازه گیری شد. این دما به عنوان دمای کنترل در نظر گرفته شد. سپس عصاره فیلتر شده پودر استخوانی از طریق وریدگوش خرگوش به بدنش تزریق شده و دمای بدن خرگوش برای مدت زمان 1 تا 3 ساعت پس از تزریق بافواصل زمانی 30 دقیقه ای بررسی و ثبت شد.

يافته ها: در هیچ یک از نمونه های مورد بررسی، افزایش درجه حرارت رکتال خرگوش ها از حد آستانه تب زایی (0/5 درجه سانتی گراد) تجاوز نکرد.

نتيجه: باتوجه به <151 USP< ماده آزمون Bone+B، فاقد اثر تب زایی می باشد.

- ارزیابی حساسیت زایی

هدف: بررسی اثر حساسیت زایی Bone+B

10 موش از گونه NMRI توسط روش MEST، به مدت 3 الی 4 روز به صورت (داخل پوستی و اپیدرمی) در معرض ماده آزمون قرار گرفتند. برای انجام تست MEST، صد میکرولیتر از حداقل غلظت تحریکی ماده مورد آزمایش برای 4 روز متوالی بر روی ناحیه ای از شکم موش به صورت موضعی قرار داده شد و 10 روز پس از تیمار آخر، میزان التهاب و قطر هر دو گوش موش ها در فواصل زمانی 24 الی 48 ساعت پس از انجام آزمایش توسط میکرومتر اندازه گیری شد.

یافته ها: با توجه به حد آستانه برای مثبت در نظر گرفتن پاسخ حساسیت زایی (%5)، نتایج تست MEST مورد ارزیابی قرار گرفتند. در هیچ یک از نمونه های مورد بررسی افزایش سایز گوش موش ها از آستانه حد پذیرش تجاوز نکرد.

نتيجه: با توجه به بخش 10 از استاندارد 10993، ماده آزمون Bone+B فاقد اثر حساسیت زایی می باشد.

- ارزیابی تحریک زایی پوستی

هدف: بررسی اثر تحریک زایی پوستی Bone+B

برای بررسی اثر تحریک زایی Bone+ B، سه گروه 4تایی از خرگوش های بالغ به عنوان گروه آزمون، تحت آزمایش به روش های single irritation و repeated irritation قرار گرفتند. برای هر بار انجام تست، چهار خرگوش انتخاب شده و ناحیه پشتی سمت راست انتهایی و سمت چپ جمجمه ای خرگوش ها با عصاره حاصل از Bone+B در محلول نرمال سالین تیمار شد. مدت زمان تیمار برای تست single irritation چهار ساعت و برای تست repeated irritation سه روز متوالی در نظر گرفته شد. تحریکات پوستی درجه بندی شده و در دو دسته تشکیل اریتما و زخم بر روی پوست و تشکیل ادم قرار گرفتند. سپس با گذشت 1، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار، واکنش های پوستی گروه آزمون مورد ارزیابی قرار گرفت و امتیازات به دست آمده مورد ارزیابی قرار گرفتند.

يافته ها: باتوجه به حد آستانه برای مثبت در نظر گرفتن پاسخ تحریکات پوستی، هیچ یک از نمونه های مورد بررسی، از آستانه حد پذیرش تجاوز نکرد.

نتيجه: باتوجه به بخش 10 از استاندارد 10993، ماده آزمون Bone+B فاقد اثر تحریک زایی می باشد.

- ارزیابی سمیت دوزهای مکرر

هدف: بررسی سمیت سیستمیک Bone+B

برای بررسی اثرات سمیت سیستمیک پودر استخوان Bone+B، از 40 رت سالم، بالغ و با منشا شناخته شده استفاده شد. برای انجام تست، حیوانات به صورت تصادفی چهار گروه 10تایی گروه بندی شدند. عملکرد ماده مورد آزمایش ممکن است سبب ایجاد تغییر در میزان آب و غذای مصرفی و وزن بدن حیوانات مورد آزمایش شود. به همین علت، وزن همه حیوانات به صورت انفرادی 24 ساعت قبل از تزریق عصاره Bone+B اندازه گیری شد. تمامی حیوانات یکبار در هفته در طول دوره مدت 45 روزه مطالعه در معرض دوز مناسب ماده مورد آزمایش قرار گرفتند. همچنین در زمان مطالعه سمیت مکرر دوزها، تغییرات وزن بدن، مشاهدات کلینیکی و پاتولوژی، آسیب های نامطلوب، وزن اندام ها و آسیب های بافتی مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین حیوانات به صورت روزانه تحت نظر بوده و هرگونه تغییرات رفتاری و بصری در حیوان پس از تزریق دارو، مورد ارزیابی قرار گرفت.

یافته ها: مدت زمان مطالعه سمیت سیستمیک بر اساس بخش 11 استاندارد 10993، 45 روز در نظر گرفته شده است. به طور کلی دوزی که سبب کاهش وزن 10% یا بیشتر وزن بدن حیوانات شود، دوز سمی نامیده می شود، که پس از گذشت این زمان و باتوجه به نتایج به دست آمده، در هیچ یک از حیوانات، تغییر وزن حیوانات به میزان ذکرشده، مشاهده نشد. همچنین در ارزیابی نتایج مشاهدات کلینیکی و پاتولوژی، آسیب های نامطلوب، وزن اندام ها و آسیب های بافتی، هیچ گونه تغییری مشاهده نشد گونه تغییر غیر عادی علائم بالینی و حیاتی پس از مصرف و تزریق ماده مورد آزمایش در حیوانات مشاهده نشد.

نتيجه: باتوجه به بخش 11 از استاندارد 10993 و ارزیابی نتایج به دست آمده، ماده آزمون Bone+B فاقد اثر سمیت سیستمیک می باشد.

- مطالعات حیوانی برای ارزیابی عملکرد زنوگرافت Bone+B

هدف: بررسی عملکرد Bone+B در ترمیم آسیب های استخوانی

برای بررسی عملکرد Bone+ B در ترمیم و القا استخوان سازی در محل آسیب بافتی از روش Implantation در مدل ضایعه استخوانی با اندازه مشخص در استخوان جمجمه رت (Rat calvarial defect) استفاده شد. برای این منظور40 رت بالغ با وزن حدود 250 گرم استفاده و به صورت تصادفی به دو گروه 20تایی تقسیم شدند.

رت ها با استفاده از KETAMINE (40MG/KG) و Xylazine (10mg/kg) بیهوش و پس از ایجاد برش بر روی پوست و کنار زدن پرده پری اوستئوم، به وسیله تره فاین یک شکاف دایره ای به قطر 8 میلی متر و ضخامت یک میلی متر بر روی جمجمه رت ها ایجاد شد. در 20 رت محل ضایعه با استفاده از Bone+B پر شد و در 20 رت دیگر محل ضایعه با نمونه پودر استخوانی خارجی OCS-B به عنوان کنترل، گرافت شد. هفته چهارم و هشتم پس از جراحی، تمامی رت ها در معرض گاز کلروفرم قرار گرفته و کشته شدند. پس از مرگ نمونه بافتی از محل implantation تهیه شده و توسط Hematoxylin و Eosin رنگ آمیزی شدند.

یافته ها: چهار هفته پس از Implantation در هر دو گروه مورد بررسی، در اطراف ناحیه پیوند سلول های استئوبلاست و رگ های تازه شکل گرفته، مشاهده شد. هشت هفته پس از انجام ایمپلنت، در هر دو گروه مرز بین استخوان میزبان و استخوان تازه شکل گرفته تقریبا بطور کامل از بین رفته است. میزان استخوان تازه تشکیل یافته در هر دو گروه به میزان چشمگیری افزایش یافته است.

نتيجه: باتوجه به بخش 6 از استاندارد 10993، اگر چه ترمیم استخوان در ناحیه جمجمه پس از 8 هفته کامل نمی شود و نیازمند زمان بیشتری است ولی نتایج حاصله در این مدت تائید کننده توانایی Bone+B در استخوان سازی و رگ زایی و همچنین شباهت با نمونه مشابه خارجی است.